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Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments.

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This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly click here slices and stagnant filter programmi di perdita di peso ihc.

Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself.

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È il caso, ad esempio, degli adenocarcinomi della regione ascellare nelle donne, trattati al pari dei tumori mammari, oppure dei carcinomi poco differenziati del mediastino o del retroperitoneo in giovani maschi, trattati come i tumori a cellule germinali extragonadici. Andrebbero inoltre eseguiti esami ematochimici di funzionalità midollare, epatica, renale, una TC del torace, addome e pelvi.

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Colin P. Edwin R. Otoferlin è una grande proteina dominio multi-C2 proposto di agire come un sensore di calcio che regola sinaptica vescicole esocitosi in cellule ciliate cocleari.

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Anche se mutazioni in otoferlin sono stati associati con la sordità, il suo contributo alla liberazione di neurotrasmettitori è irrisolto.

Utilizzando un saggio fusione delle membrane ricostituito, abbiamo scoperto che cinque dei sei C2 dominii otoferlin stimolare fusione delle membrane in modo calcio-dipendente.

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Dimostriamo anche che il legame con deficit di un calcio sotto forma di dominio C2C è in grado di stimolare la fusione delle membrane, sottolineando ulteriormente l'importanza del calcio per la funzione della proteina.

La coclea è un tubo a spirale piene di liquido trovato all'interno dell'orecchio interno, dove svolge un ruolo centrale nella audizione dei mammiferi.

In risposta al suono, fasci capelli situati su cellule ciliate all'interno della coclea sono deviati, causando l'apertura dei canali ionici meccanosensibili che alterano la tensione della membrana cellulare.

Otoferlin verifica in molteplici varianti di splicing, compresa una forma acida 1.

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Questi topi hanno anche neuroni afferenti funzionali, suggerendo che il ruolo di otoferlin nel percorso uditivo si trova all'interno della cellula pelo tra le trasduzione e afferenti attivazione dei neuroni passi mechanoelectrical.

Tuttavia, gli studi di localizzazione subcellulare hanno portato a conclusioni contrastanti. In particolare, se otoferlin è infatti un sensore di calcio coinvolte nel rilascio di neurotrasmettitore, ci aspetteremmo forme ricombinanti della proteina di legare calcio, SNAREs, e membrane e di accelerare SNARE mediata fusione delle membrane in modo calcio-dipendente.

In questo studio, abbiamo proiettato l'individuo otoferlin domini C2 per queste proprietà per determinare se otoferlin opera come programmi di perdita di peso ihc sensore di calcio.

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Inoltre, una grande tre C2 costrutto dominio, C2DEF, è stato creato per verificare le proprietà del segnalato piccolo tre C2 variante di splicing del dominio.

Un costrutto C2ABC è stato analizzato in parallelo per determinare quali sono i domini aggiuntivi tre C2 N-terminali, che si programmi di perdita di peso ihc nella isoforma più grande, contribuiscono alla funzione della molecola.

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Otoferlin è un sensore di calcio. Fernandez et al, L'allineamento della sequenza primaria dei domini C2 otoferlin con residui aspartato leganti il calcio di synaptotagmin I rivela una mancanza di conservazione programmi di perdita di peso ihc i primi tre domini C2 N-terminale della proteina Fig. Pertanto, non è chiaro dal controllo della sequenza da cui dominii otoferlin eventuali legare il calcio.

Per rispondere a questa domanda, abbiamo esaminato la fluorescenza intrinseca dei costrutti otoferlin ricombinanti in funzione della concentrazione di calcio.

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Visualizza versione più grande:. Figura 1. Schema di full-length otoferlin ei frammenti otoferlin utilizzati in questo studio. Come una schermata iniziale per legare il calcio, gli spettri di fluorescenza di costrutti ricombinanti otoferlin sono stati misurati in presenza sia di 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio.

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Questi cambiamenti sono stati più di primo piano nelle grandi tre frammenti C2 dominio, con il frammento N-terminale C2ABC visualizzazione di un cambiamento notevole blu e la C2DEF un leggero spostamento verso il rosso. Per verificare la specificità del legame di calcio, gli esperimenti di titolazione sono stati ripetuti in presenza di magnesio 0,75 mM.

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Magnesio non ha avuto effetto sui calcio di dose-risposta, indicando che il legame è specifico per il calcio dati non pubblicati. Visualizza questa tabella:.

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Tabella I. Figura 2.

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Normalizzato spettri di emissione di fluorescenza di nativi catene laterali aromatiche otoferlin in presenza di 0,1 mM EGTA o calcio 1 mM. Sono mostrati spettri rappresentante per ogni dominio in condizioni EGTA o di calcio. Le tracce sono dati rappresentativi dei quattro studi clinici indipendenti.

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FI, intensità di fluorescenza. Figura 3. Cambiamenti calcio-dipendenti in fluorescenza otoferlin.

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Binding è spesso dipendente dal calcio, con il catione, proteine, lipidi e formando un complesso con un'affinità proteina calcio-binding migliorata. Analogamente ai campioni senza liposomi, tutti i costrutti otoferlin tranne C2A visualizzato aumenti fluorescenza in presenza di calcio rispetto alle misurazioni effettuate in EGTA.

Concludiamo che otoferlin lega calcio via almeno cinque link suoi sei domini programmi di perdita di peso ihc che le membrane aumentare il legante il calcio affinità apparente di questi domini. Tuttavia, sono stati esaminati né i domini specifici di otoferlin che legano t-SNARE né gli effetti del calcio sulla rilegatura.

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Il legame di altri due domini, C2A e C2B, non è stata arricchita da calcio. Figura 4. A I saggi sono stati eseguiti utilizzando 20 mM di ciascun dominio C2 usando un anticorpo monoclonale anti-sintaxina.

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